bsa法基因定位的过程,bsa性状定位
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《BSA》-生信笔记---003
背景介绍
一、什么是BSA?
BSA（Bulked Segregant Analysis）---混合分组分析法
根据目标性状表现型，对表型分离群体中的个体/株系依据目标性状，分成性状差异显著的两组
然后将 两组 的个体或株系DNA分别 等量混合 ，形成性状相对的 DNA混合池 。
再然后 建库 、 测序 、 分析 的方法（根据亲本间纯和差异的位点，计算子代池的index值，进而挑选差异较大的位点
可以实现目标性状的基因定位
二、BSA适应的群体类型
三、BSA分析的目的
通过对极端性状产生机理的研究与发展，完成家系材料单性状基因的定位，揭示性状相关机制，应用实际生产过程中， 达到育种期望，提高生产效益。
选择样本：极端亲本1和2；极端子代混池1和2
主要分析的内容：根据SNP/INDEL频率差异分析，确定与极端性状紧密相关的分子标记，并完成定位基因；目的基因功能注释。
四、生物信息分析流程
1、GATK 群call--vcf
2、变异位点注释
3、index计算
3.1 挑选亲本间纯合差异的位点
3.2 SNP-index的计算（极端亲本P1为参考，分别计算两个子代在亲本间上述标记位置上的SNP-index）
候选位点：挑选极端性状子代混池1（跟参考亲本性状相同）的SNP-index接近0，且子代2（与参考亲本性状相反）的SNPindex接近1的位点
3.3 选择1Mb为窗口，1kb为步长，计算每个窗口中SNP-index
4、目标性状的定位
对于候选的多态性标记位点进行ANNOVAR的注释，提取注释结果，优先挑选upstream或者引起stop loss或者stop gain或者非同义突变或可变剪接的位点所在的基因作为候选基因；
4.1. 外显子上的候选位点：
4.2.nonsynonymous的位点所在基因以及upstream相关基因：
5、目标基因的定位
五、流程回顾
六、常见问题
1、简化基因组BSA比全基因组BSA价格便宜?
答:简化基因组技术,捕获的基因组信息占基因组大小约1%~10%,全基因组技术,对至少25倍
2、简化基因组测序适合做BSA性状定位吗?
答:针对微效多基因控制的数量性状,与目标性状相关的位点很多,简化基因组或许有幸捕获到少数位点,但绝大部分会被遗漏,这对后续的研究很不利。针对质量性状或由少数主效基因控制的数量性状,简化基因组BSA的方法风险更高。全基因组BSA性状定位与简化基因组BSA性状定位见表2-1
3、子代混池的样品个数和测序深度如何设计?为什么?
答: 2013年, James等对混池个体数和测序深度对候选基因数的影响进行了评估。下图是评估结果,结果显示,当子代个数超过20个,测序深度达到25x以后,候选基因个数会趋于平衡,不会有更明显的提升效果。基于以上文章经验以及已完成的BSA项目经验,推荐20个个体进行混池,每池20×的测序深度。
4、DNA样品如何混池?先混样再提DNA?还是先提DNA再等量混合?
答:先提DNA再等量混合,可以减少系统误差,近年发表的多数文献都是先提DNA再等量混合。
5,能否只测亲本?或者只测子代池?或者只测1个子代池?
答:分两种情况:
1)如果研究的性状是EMS诱导的突变性状,可以只测两个子代池(野生型+突变型)或者测1个亲本(野生型)和1个子代池(突变型)。
2)如果研究的性状是数量性状,最好测2个亲本和2个子代池,用一个实际在线项目评估了样品个数对分析结果的影响,其中4个样品的结果最好(也即2个亲本+2个子代池),其次是测一个亲本和两个子代池,如果只测两个子代池,假阳性会很高,找出来的SNP很多(下表)。
6,能否保证定位到的候选区域的大小和候选基因的个数?
答:候选区域的大小和候选基因个数的多少,与群体的大小、亲本材料差异的大小、目标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组水平等多项因素相关,因此不能给出统一的标准,但可以参考已完成的项目经验进行估计。
7,没有参考基因组的物种能否做BSA性状定位?
答:没有参考基因组的物种可以进行SNP频率差异分析,可以找到侯选这段,但是无参定位效果较差,并且缺少注释文件,获得的结果少无参物秤一般情况不推荐做BSA性状定位,建议尝试遗传图谱等方案。
8,多倍体物种可以进行BSA性状定位吗?
答:有参考基因组的多倍体物种,例如: “油菜",可以用BSA进行性状定位。
9, BSA性状定位可以利用InDel进行定位分析吗?
答:使用SNP标记进行定位的主要原因是SNP在基因组上的分布密度要比InDelSSR,SV,CNV等要高,使用SNP标记可以找到比较精确的区间。找到候选区间之后,可以对候选区间中的InDel和其他变异进行检测。直接利用InDel信息进行定位缺少文献支持,并且定位效果不如SNP效果好。
10,人工诱变只能是EMS诱变嘛?其他诱变方式得到的性状可否采用BSA性状定位?
答: BSA性状定位是基于SNP,通过比较SNP频率差异进行分析的, EMS诱发的是点突变,所以EMS诱发的突变适合这种分析方式;其他的诱变方式诱发的大部分是结构变异,在SNP水平上可能找不到导致目标性状差异的区域，所以不适合SNP频率分析的方法。
11,全基因组(WGS ) BSA性状定位与转录组(RNAseq )进行性状定位的比较。
答: 2013年,Henke等总结了全基因组BSA相比转录组( RNAseg进行性状定位的优点
1)覆盖范围:全基因组BSA可以覆盖整个基因组, 98%的编码区可以覆盖到。而RNAseq只对编码区进行测序。
2)基因检测的偏好性:全基因组BSA对基因的检测较均匀,无偏好性,不受时间或者组织的影响。RNAseq偏向于在特定时间或者组织中高表达的基因。
3)区域偏好性:基因分布不均匀,若一些区域基因密度低,用RNAseq可能漏掉。
4)多态性:基因组的多态性多数位于非编码区,采用RNAseq检测到的多态牲较低,只有少数与突变位点连锁的多态性标记能被RNAseq检测到。
因此,采用全基因组BSA更容易检测到与目标基因连锁的多态性标记。
后续更新。。。。。
QTL-seq（数量性状）
MutMap（点突变性状）
InDel-seq（InDel突变性状）
转录组BSA
什么是分群分析法（BSA）
BSA法: 该方法将F2分离群体中研究的目的性状，根据其表型(如感病和抗病)分为两组，分别提取两组单株的DNA，等量混合，并用作模板进行标记分析。如果某一引物扩增两个群体的DNA而表现出多态性，则表明该多态性片段与目标性状基因连锁，然后用筛选出的有连锁关系的几个引物对分离群体的单株DNA进行扩增，找出更紧密连锁的分子标记。
动植物重测序--BSA
针对目标性状，选择 表型极端差异的亲本 构建家系，对该家系 目标性状表型极端的子代 分别混合得到的两个样本池进行全基因组重测序，检测到的两池间DNA差异片段即为候选区域，可进一步定位到目标性状相关的基因或标记。利用该方法，可以快速的对单一性状进行精细定位，加速目标性状的功能基因组研究进程。
对，BSA最主要的要求就是研究的这个性状在亲本和子代中一定是极端差异，这样结果才能更准确。
样本要求：2个亲本+2个子代池（每个子代池≥20个样本）（200mg组织够提DNA即可）
文库类型：WGS文库（有参）
测序数据量：亲本10x/个，子代池≥20x/池（若子代池混样30个，就测30x）
子代池选择：家系群体（F2，RILS，BC，DH等）
1）参考基因组：参考基因组组装质量好坏以及注释是否完全对BSA结果有一定的影响。建议尽量选择组装至染色体水平，且基因组注释较完全的参考基因组。
2）分离群体：理论上任何一对具有相对性状的亲本杂交后产生的分离后代都适用于集群分离分析法。但常用的分离群体为：F2代群体、回交群体、重组自交系、双单倍体群体。
3）亲本选择：亲本间目标性状要求差异显著，尽量选用纯度高的亲本，并进一步通过自交进行纯化；并且，除了关注的1个目标性状外，其他性状尽量一致，无其他性状发生分离。
4）混池个体数：混池的样本数通常选取极端性状（群体总样本数的5～10%内）的个体进行混池。混池中若极端性状个体数太少，可能造成样品数不够，不具备代表性；若样本数过高可能会引入杂合个体，产生干扰。
5）表型统计：表型统计不准确，或表型由多个微效基因控制，可能会引起定位效果不佳。
1、群体完整度对定位效果的影响？
下表参考链接中有经验统计。2 亲本+2 子代池是最优选择，次之为⼀个亲本+2 个子代池；再次为 2 个亲本+1 个子代池； 1 个亲本+1 个子代池；最次为只有子代池，如果只有亲本，那么建议⽼师去做变异检测。若是 mutmap （突变体与野生型杂交），则可提供1个野生型亲本+1个突变型子代池，或者两个子代池。不同群体的index算法原理上稍有不同。
2、如果该物种没有参考基因组怎么办？或者如果样品是两个品种的杂交后代，⽽两个品种都有参考基因组，该选择哪个参考基因组？
如果该物种没有参考基因组，⽽近缘物种有参考基因组，可以选择近缘物种的参考基因组进⾏⽐对分析。如果两个品种都有参考基因组，则要根据样品的表型和其他数据选择⼀个与样品差异较⼩的品种作为参考基因组。
3、如何构建混池？混池规模多⼤能够满⾜要求？
通过表型调查，筛选具有极端表型的个体构建两个混池，质量性状（1： 2： 1） 具有主效位点的数量性状（正态分布）。表型统计不准确，或由多个微效基因控制，会影响定位效果。混池个体性状不极端，存在较多中间型，同样会导致定位结果不佳。⼀般选择群体的 5%到 10%个体构建极端混池，建议极端样品在 30+30 以上。通常在样本量等情况允许的条件下越⼤越好，能够更进⼀步的缩⼩候选区域。具体需根据物种、样本情况等设计方案。
4、简化基因组测序适合做 BSA 性状定位吗？
针对微效多基因控制的数量性状，与⽬标性状相关的位点很多，简化基因组或许有幸捕获到少数位点，但绝⼤部分会被遗漏，这对后续的研究很不利。针对质量性状或由少数主效基因控制的数量性状，简化基因组 BSA 的⽅法风险更⾼。诺⽲致源不做简化基因组的 BSA性状定位。
5、能否保证定位到的候选区域的⼤⼩和候选基因的个数？
候选区域的⼤⼩和候选基因个数的多少，与群体的⼤⼩、亲本材料差异的⼤⼩、⽬标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组⽔平等多项因素相关，因此不能给出统⼀的标准，但可以参考已完成的项⽬经验进⾏估计。
6、BSA 能否检测 SV、 CNV？
不建议⽤ BSA 的结果检测 SV、 CNV，第⼀、测序深度不够；第⼆、 BSA ⼦代是混池样本，混池样本做⼤结构变异检测误差较⼤，且没有分析意义； 想做⼤结构变异检测，建议⽤新技术做， Bionano、三代、 10X Genomics 或者测 30X ⼆代做分析。
该方法参考于2019年7月发表在《自然-通讯》（ Nature Communications ）杂志上发表了题为 Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy 的研究论文。
文中将F2群体不同表型均进行了混池测序，100-150个个体/池，个体平均测序深度0.5x，测序数据比对，变异检测，SNP标记筛选，统计检验-背景降噪-定位。这个降噪后分析结果看上去要比SNP-index的结果简单很多，精度也会高。如果样本足够，经费阔绰，建议可以用这个分析方法尝试一下。
参考学习：
1、 BSA你真得懂了吗?
2、 BSA的原理
3、 GPS的论文 报道
混合（Pooling）样本测序研究
测序成本虽然下降了，但对于植物育种应用研究来说还是很高，动不动就上百群体，小小植物个体价值又低，测完了很可能后面就用不到了。这时，混合样本测序是一种省钱的好办法。
混池测序（Pool-seq）相对于GWAS或其他精细定位策略而言，其实是一个初定位产品，其结果很有可能是跟性状相关的候选区域。
概念：
混合样本测序一般是选择表型极端或目标性状差异的个体混合，构建一个文库进行测序。
原理：
假设每个样本被测到的概率相等，通过测序reads数计算等位基因频率。如果基因与研究性状有关，那么理想情况下，表型差异显著的混合样本中，该基因等位基因频率差异显著。
不足：
影响因素及建议：
对于隐形纯合点突变，效果较好。
MutMap和MutMap+是利用SNP-index算法，需要参考基因组，如果目标位点位于参考基因组没有组装上的gap区，或是参考基因组不具有的序列中，利用MutMap检测方法就不能有效检测到目标突变位点。
MutMap-Gap方法结合了MutMap和de novo组装。先通过MutMap分析SNP-index peak区，发现找不到跟突变性状相关的基因，再将之前比对不上参考基因组的野生型亲本unmapped reads和MutMap分析中SNP-index peak区域的野生型亲本比对上的reads一起进行de novo组装，获得潜在的新基因，并以此为参考再计算SNP-index，检测目标突变位点。
BSA（Bulked segregant analysis，混合分组分析），利用目标性状存在极端表型差异的两个亲本构建分离群体，在子代分离群体中，选取两组表型差异极端的个体分别构建混合池 ，结合高通量测序技术对混合样本测序，比较两组群体在多态位点（SNP）的等位基因频率（AF）是否具有显著差异，定位与目标性状相关联的位点并对其进行注释，研究控制目标性状的基因及其分子机制。
SNP-index是主流的BSA定位算法。其原理是构建子代分离群体，经过挑选极端性状构建混池后对SNP进行检测，对各混池进行等位基因频率分析，并 与其中一个亲本进行比较 。与此亲本不同的基因型所占的比例，即为该位点的SNP-index。
（注意这里的reference并不是变异检测的参考基因组，而是构建群体所使用的亲本，所以SNP-index计算高度依赖于亲本测序数据。）
两个混池相减（上图右）得到了△SNP-index的结果，即两个混池之间SNP基因型频率的差异。理论上说，不与性状相关的位点，△SNP-index的值应当在0左右，代表混池之间不存在差异；而QTL及其相连锁位置的SNP，△SNP-index值应当呈现较高的数值。
△SNP index会存在因统计偏差造成的假阳性位点，可以通过计算滑窗内所有SNP的△SNP-index，来消除其影响，得到真正QTL所在的基因组区域。
其他算法如欧几里得距离(ED)，Gradedpool-seq（Ridit检验）等。
这里的BSA是指狭义上的QTL-seq，针对有主效基因的数量性状。实际上上面的质量性状/点突变性状、InDel-seq（InDel突变性状）以及下面的BSR，都属于BSA的范畴，原理相似。此外还有QTG-seq。相应的Pipeline可参考：
BSR（Bulked segregant RNA sequencing）同样依据分组混合的原理，在RNA水平上进行高通量测序并定位候选基因，即BSA+RNAseq。BSR的混池同样选取分离群体中的极端性状单株，混池用的单株数会比BSA多一些（大多大于30），提取RNA进行混池，再进行转录组测序，mapping参考基因组后同样进行变异分析，确定候选区间。BSR的优势在于不仅提供变异信息，还能提供候选区域中基因的表达信息。
BSR的劣势：RNAseq只能检测表达基因上的SNP，检测的SNP数量少，一般只适用于高频的SNP。同时由于存在RNA编辑等问题，RNA层面检测的SNP和DNA层面也是有差别的，所以只有当DNA层面无法实现（复杂基因组）或DNA测序成本过高（超大基因组）等情况下可选择BSR，否则还是优先选择BSA。
Pool –GWAS也是一种省钱策略，但还是非常小众。
比如： GWAS study using DNA pooling strategy identifies association of variant rs4910623 in OR52B4 gene with anti-VEGF treatment response in age-related macular degeneration
Pool –GWAS研究复杂遗传背景的性状功效降低，对稀有变异的检测能力下降。
同样，分析获得的驯化相关位点很多，如果想用类似的方法检测复杂性状相关位点，后续挖掘真正的功能位点的难度还是很大。
Ref：
2. BSA的原理
BSA（Bulked Segregant Analysis），集群分离分析或分离群体分组分析法。
两个特点：
1. 混池
2. 性状分离
所以，BSA可以称之为分析有性状分离的群体分析方法。
性状控制基因的初步定位
